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早期肠道微生物组调制降低了抗生素抗菌细菌的丰富GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

抗生素抗性(AR)细菌是全球威胁。可以在早期生命中获得ar细菌并具有长期的后遗症。限制抗生素抗性的扩散而不引发额外的抗性机制的发展是巨大的临床价值。在这里,我们展示了如何修饰婴儿肠道微生物组,导致ar基因(args)和潜在的遗产致病细菌的显着减少。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

利用猎枪宏基因组学对两组健康足月母乳喂养婴儿的粪便样本进行了肠道微生物组特征分析。一组被喂食GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001除了接受泌乳支持(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba = 29, EVC001-fed), while the other received lactation support alone (N.GydF4y2Ba= 31,控制)。从粪便样本中分离大肠菌群并进行基因组测序,并检测对临床相关抗生素的最低抑菌浓度。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

婴儿美联储GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001对肠道微生物组的变化表现出变化,导致与对照相比,args级别90%。在组之间显着不同的args,预计赋予β内酰胺,氟喹啉或多种药物类别的抗性,其中大多数属于GydF4y2Ba埃斯克里希亚洲GydF4y2Ba那GydF4y2BaClostridium,GydF4y2Ba和GydF4y2Ba葡萄球菌GydF4y2Ba.最低抑菌浓度测定证实了具有这些基因的分离株的抗性表型。值得注意的是,我们在从未接触过抗生素的健康、经阴道分娩的母乳喂养婴儿中发现了广谱-内酰胺酶。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

在母乳喂养的婴儿的肠道中有一种GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba无性系种群。GydF4y2Ba对象的GydF4y2Ba对粪便宏基因组产生了深远的影响,包括arg的减少。这突出了开发新方法来限制这些基因在临床相关细菌中的传播的重要性。需要进一步的研究来确定是否用GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001降低了母乳喂养婴儿AR感染的发生率。GydF4y2Ba

试验注册GydF4y2Ba

该临床试验注册于GydF4y2BaClinicalTrials.govGydF4y2Ba, NCT02457338。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

在美国,每年有200多万人患上耐抗生素感染,至少23000人因此死亡[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].此外,据估计,造成卫生保健相关感染的细菌中有70%以上对全球作为一线治疗使用的至少一种抗生素具有耐药性[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].因此,耐药细菌感染需要更长的治疗期,这每年耗费美国卫生保健系统估计50亿美元[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

抗生素耐药性是一种自然现象,起源古老,是进化的产物,早在人类世之前就在环境中发生了[GydF4y2Bavwin000官方网站 ];然而,自二十世纪的抗生素商业发展以来加速了它。特别是,对人类和动物的抗生素施用增加引起了巨大的选择性压力,有利于涉及赋予抗生素抗性的遗传元件的细菌[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].这些元素中的许多元素是可转移的,并且随着通过暴露于抗生素,消毒剂和重金属而介导的人类活动的直接结果的流行增加[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

下一代测序技术的快速升级,特别是偏心神经,已经产生了一种非凡的环境突破环境利基的数据分析,具有人体肠道微生物组本身作为共生生物中args的主要水库[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].总体而言,与其他环境相比,人类肠道微生物群拥有更多arg [GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].此外,共生细菌可能在arg的进化和传播中发挥关键作用,即使它们不是抗生素治疗的预期目标[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ]最近的证据表明,在出生后或不久,患有args的母体肠道微生物被转移到新生儿[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].这代表了人类健康的大量风险,因为args可以从出生时获得的共生细菌转移到病原体[GydF4y2Bavwin000官方网站 两者都可以轻松在个人之间传播。此外,即使没有长期抗生素暴露,抗性基因也可以在人体肠道中持续存在。例如,在抗生素治疗停止后,args已经鉴定为4年,表明抗生素抗性可以在没有选择性压力的情况下持续存在不确定的时间[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

从历史上看,GydF4y2Ba双歧杆菌属GydF4y2Ba被推测在美国和欧洲的健康母乳喂养婴儿中比今天更丰富,考虑到美国和欧洲婴儿相对于撒哈拉以南非洲和东南亚的差异,这些地区的传统出生和婴儿喂养方式占主导地位[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].然而,当双歧杆菌不存在时,其他类群包括GydF4y2BaProteobacteriaceae,Brageocaceae,Staphylococaceae,ClostrideaceeGydF4y2Ba主要存在于母乳喂养的婴儿肠道中[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].尽管这些分类在不同程度上与潜在的长期负面健康结果有关[GydF4y2Bavwin000官方网站 ],它们也是临床相关args的主要水库[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].我们最近展示了母乳喂养的婴儿肠道微生物组中出现了广泛耐用的变化GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Ba无性系种群。GydF4y2Ba对象的GydF4y2Ba(GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba)EVC001 [GydF4y2Bavwin000官方网站 ]而其他人表明,具有较高水平的双歧杆菌的母乳喂养婴儿具有降低的丰富和较低频率与抗生素抗性相关的基因[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

在这里,我们使用散弹宏基因组学来描述干预的效果GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001关于母乳喂养婴儿的丰富args。我们发现殖民化因GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001导致arg和藏匿它们的细菌显著减少。GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

样品收集GydF4y2Ba

临床试验设计的细节已经报告了[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].简单地说,在北加利福尼亚(美国)的戴维斯和萨克拉门托都市地区招募了母婴对,并在登记前获得了母亲的知情同意。在对照组中,只有一名受试者在样本采集和测序前直接服用了抗生素。否则,29%的控制婴儿和31%的EVC001-fed婴儿通过剖腹产出生的,32%的控制婴儿和45%的EVC001-fed婴儿出生时母亲给抗生素劳动和控制婴儿的16%和31%的EVC001-fed婴儿出生母亲测试为B组GydF4y2Ba链球菌GydF4y2Ba积极的。这些临床变量均未在组之间显着差异(附加文件GydF4y2Bavwin000官方网站 :表S1)。evc001喂养组婴儿喂养1.8 × 10GydF4y2Ba10GydF4y2BaCFU的GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001(ATCC SD-7035)连续21天从第7天到第27天出生的第27天。GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001递送为156毫克活细菌(> 1.8×10GydF4y2Ba10GydF4y2Ba CFU) diluted in 469 mg of lactose as an excipient and packaged in single use sachets. Mothers were trained by lactation consultants to mix the contents of the sachet in 5 mL of expressed breast milk and feed this to the infant each day. The probiotic was stored at − 20 °C by the families during the study and stability at − 20 °C was confirmed by a plate count.

DNA分离和猎枪宏基因组测序GydF4y2Ba

先前,DNA预先从第21天从婴儿收集的约100mg冷冻粪便中提取[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].简单地说,根据制造商的说明,在使用Zymo粪便DNA迷你prep试剂盒进行柱纯化之前,DNA要经过珠击。样本与剩余的原料和足够的提取DNA符合输入质量标准,由制造商定义,被选择测序。确定了60个符合这些标准的样本。宏基因组猎枪测序由加州定量生物科学研究所(QB3)(加州大学伯克利分校)在Illumina HiSeq 4000平台上进行,采用配对测序方法,目标读取长度为150 bp,插入大小为150 bp。GydF4y2Ba

质量过滤和去除人类序列GydF4y2Ba

多路分解的FASTQ序列是质量过滤,包括使用Trimmomatic V0.36的适配器修剪[GydF4y2Bavwin000官方网站 ],使用默认参数。筛选优质过滤的序列以使用Gencof V1.0 [GydF4y2Bavwin000官方网站 针对非冗余版本的Genome Reference Consortium Human Build 38, patch release 7 (GRCh38_p7;GydF4y2Bawww.ncbi.nlm.nih.govGydF4y2Ba).在序列读取档案中沉积人序列过滤的原始读数(SRA;GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra.GydF4y2Ba)在参考号下,prjna390646。GydF4y2Ba

分类学和菌株分析GydF4y2Ba

使用MetaPhlAn2对宏基因组样本进行分类分析[GydF4y2Bavwin000官方网站 ],它使用分枝特异性标记库提供泛微生物(细菌、古细菌、病毒和真核生物)图谱(GydF4y2Bahttp://huttenhower.sph.harvard.edu/metaphlan2.GydF4y2Ba).使用PANPHLAN进行应变表征[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].PanPhlan与MetaPhlAn2结合使用来描述一个选定生物体标记基因的菌株水平变异。对于PanPhlan分析,来自GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Ba(GydF4y2Bahttps://bitbucket.org/CibioCM/panphlanGydF4y2Ba)被用作参考。Metaphlan2和Panphlan都与其默认设置一起使用,如更新的人类微生物组项目(2017)的全球分析中所述[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

的绝对量化GydF4y2Ba肠杆菌科GydF4y2Ba通过QRT-PC实时PCRGydF4y2Ba

总量的量化GydF4y2Ba肠杆菌科GydF4y2Ba通过使用群体特异性16S rRNA基因引物en-LSU3F(TGCCGTAACTTCGGAGAAGGCA)和EN-LSU3(TCAAGGCTCAATGTTCAGTCTC)进行定量实时PCR进行[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].每个反应包含10 μL的2× Power SYBR Green PCR主混合(Applied Biosystems)、0.4 μm的引物和1 μL的模板DNA。在QuantStudio 3 Real-Time PCR系统上进行热循环,包括在95°C下变性10分钟,然后在95°C下变性15秒,然后在60°C下变性1分钟,共40个循环。从纯培养物中提取基因组DNA生成绝对定量的标准曲线GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba与婴儿的粪便样本分离(GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba7005-1)GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba到10GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba CFU/mL.

抗生素抗性基因分析GydF4y2Ba

首先进行人过滤的读数[GydF4y2Bavwin000官方网站 管道(GydF4y2Bahttp://huttenhower.sph.harvard.edu/humann2GydF4y2Ba)随后使用Diamond V0.9.10程序筛选args [GydF4y2Bavwin000官方网站 ]针对综合抗生素抗性数据库(卡)进行Blastx型搜索[GydF4y2Bavwin000官方网站 vAugust 2017年。DIAMOND的输出使用自定义脚本进行解析和过滤,以收集每个考虑正命中读取的样本的最高命中数(i)GydF4y2BaE.GydF4y2Ba值≤10GydF4y2Ba−5GydF4y2Ba[GydF4y2Bavwin000官方网站 ];(ii)氨基酸同一性≥90%;(iii)对准长度≥25氨基酸[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41GydF4y2Ba那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].表格输出被压缩成biom格式[GydF4y2Bavwin000官方网站 ]使用自定义脚本根据卡数据库和NCBI GeneBank分配读取的分类管理注释。args的最终分类学隶属分析用梅达哥群分析仪进行(Megan V6.9)进行[GydF4y2Bavwin000官方网站 在NCBI Taxonomy系统发育树(Tree of Life)上使用最低共同祖先(LCA)方法计算和交互探索数据集的分类内容(LCA参数:最小评分35,最高百分比10%)。在总宏基因组中被确定为arg的部分序列类型或亚型被定义为相对丰度,使用ppm (1 reads in one hundred million mapping reads)的跨样本归一化方法[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

PCR扩增和抗生素抗性基因的克隆GydF4y2Ba

与EVC001-殖民化婴儿相比,七种差异丰富的args鉴定为对照婴儿显着更高(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba ≤ 0.001; Bonferroni) were selected for detection in samples by PCR and functional screening. Illumina reads annotated within the significant ARGs were retrieved and independently assembled in SPADES v3.11 [vwin000官方网站 ].然后通过BLASTX和BLASTP对NCBI非冗余蛋白数据库(nr,GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/GydF4y2Ba).为了验证粪便DNA中是否存在这些arg,我们使用Primer3 (GydF4y2Bahttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/GydF4y2Ba)(额外的文件GydF4y2Bavwin000官方网站 :表S5)。然后根据组织分析,从六个样品中分别从六个样品中分别从1μl粪便DNA扩增靶基因。通过琼脂糖 - 凝胶电泳分离扩增的片段,使用Nucleospin®试剂盒(Macherey-Nagel)纯化并使用Sanger技术进行测序(DNA测序设施UC Davis)。使用全局成对对准(ConsureElman-Wunsch)计算所获得的核苷酸序列对相应的开放阅读框架的所得核苷酸序列的百分比。还使用Blastx和Blastn和使用RPS-BLAST的蛋白质结构域数据库(PFAM)和COG数据库,对NCBI的非冗余蛋白质和NCBI的核苷酸数据库进行搜索序列。GydF4y2Ba

最小抑制浓度GydF4y2Ba

根据微量稀释易感性测试的临床和实验室标准研究所确定最小的抑制浓度(MIC)[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].在LB肉汤中过夜培养的菌株调整为1 × 10GydF4y2Ba6.GydF4y2BaCFU/mL,接种于含0.5 ~ 512 μg/mL 6种不同临床相关抗生素(氨苄西林、四环素、头孢噻肟、头孢唑林、头孢吡肟和庆大霉素)的Mueller-Hinton Broth, 96孔聚苯乙烯微滴板。滴度板37℃孵育24 h。每孔的光密度(OD)在600 nm处使用自动微量滴定板阅读器(BIO-TEK, Synergy HT)测量。MIC对应于未检测到生长的最低抗生素浓度。所有测试都是一式三份。GydF4y2Ba

细菌分离株全基因组测序和组装GydF4y2Ba

将出生后21天(受试者7005,7084,7122和7174)的粪便样本连续稀释到EMB琼脂上,在37℃下孵育过夜。从每个受试者中选择三个颜色较深和/或有绿色金属光泽的菌落进行后续分析。选定的分离菌株在37°C的LB肉汤中培养过夜。每株1 mL, 10000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba静置5min,取上清。将细胞颗粒转移到DNA/RNA Shield microlysis tubes (Zymo Research, Irvine, CA)中,使用Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit (Zymo Research, Irvine, CA)提取高分子量基因组DNA。根据制造商的协议,在FastPrep96 (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)中以1800转/分的速度进行15秒的机械裂解,提取DNA。vwin得赢手机客户端利用高分子量1kb延伸阶梯(Invitrogen, Carlsbad, CA)凝胶电泳评估gDNA的完整性。在40kb处有一个gDNA带,没有剪切,显示完整的gDNA。使用Quant-iT™dsDNA检测试剂盒(Invitrogen公司)对gDNA进行定量。采用Take3微孔紫外-可见系统(BioTek, Winooski, VT)评估gDNA纯度。根据制造商的协议,使用400ng高分子量gDNA,使用Oxford Nanopore 1D快速条形码试剂盒(SQK-RBK004) (Oxford Nanopore Technologies, Oxford UK)为每个分离物制备单独的条形码库。将条形码样品汇集在一起,根据Oxford Nanopore的推荐,在快速适配器连接之前,对片段和条形码库进行1× HighPrep PCR珠清理(MagBio, Gaithersburg, MD)。最后一个12-plex池被加载到R9.4流动池中,运行15小时。 A secondary run was performed using the same protocol for the seven isolates whose initial coverage was below 6×. Reads were basecalled in real time using MinKnow (ONT, Oxford UK). Data for both runs were combined for subsequent processing. Basecalled reads were demultiplexed and adapters were trimmed using Porechop (version 0.2.3,https://github.com/rrwick/PorechopGydF4y2Ba).读取被装配用桶v1.5 [GydF4y2Bavwin000官方网站 ],使用默认参数。将组装好的基因组转化为本地blast数据库,并使用CARD数据库中的蛋白序列对组装好的基因组进行查询GydF4y2BaE -GydF4y2Ba值设置为0.001。基因组组件沉积到NCBI基因库中(GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GydF4y2Ba)在加入号码Prjna472982下。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

两组间的统计学比较采用Mann-Whitney检验。使用Kruskal-Wallis单因素方差分析估计了evc001喂养的婴儿与对照组之间显著差异的ARGs,并结合Bonferroni校正进行跨样本归一化。在菌株水平分析中,Fisher的精确测试被用来确定基因家族的显著存在/缺失。通过计算稀疏曲线来估计已识别的arg在样本中的分布。一个非参数两个示例GydF4y2BaT.GydF4y2Ba- 最低用于使用Monte Carlo Fervutive比较稀疏曲线(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba = 999). A Bray-Curtis dissimilarity matrix was constructed to estimate the global resistome differences among the samples and visualized via a Principal Coordinate Analysis (PCoA). A Permutational Multivariate Analysis of Variance Using Distance Matrices (adonis) was used to assess global resistome differences between treatments and the effect-size (R2GydF4y2Ba), EVC001对抗性体的定殖。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba基于从原始数据排列的顺序总和的顺序总和使用F-Tests计算PCOA面板的值。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-整个手稿的值用星号表示(*,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05; **,P.GydF4y2Ba < 0.01; ***,P.GydF4y2Ba< 0.001;****,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.0001)。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

b .对象GydF4y2BaEVC001重塑母乳喂养婴儿的肠道微生物群GydF4y2Ba

利用猎枪宏基因组测序技术,我们对60名出生后21天的健康足月母乳喂养婴儿的肠道微生物群进行了分类和抗生素耐药性分析。研究设计和主题特征的细节以前已被报道过[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ],本文所分析对象的人口统计数据摘要载于附加文件GydF4y2Bavwin000官方网站 S1:表。经过质量过滤后,Illumina测序共得到16亿个PE reads,其中约3.6%被丢弃为人类基因组序列污染物,平均每个样本有2700万个PE reads(见表)GydF4y2Bavwin000官方网站 ).在人类微生物组项目更新的分析管道之后,对高质量、人工过滤的reads进行分类分析[GydF4y2Bavwin000官方网站 ](2017年9月;见GydF4y2Bavwin000官方网站 ).GydF4y2Ba

表1喂养EVC001的婴儿和对照组的宏基因组学测序结果概述GydF4y2Ba

共鉴定细菌202种,隶属于76属43科21目13纲7门(附文件)GydF4y2Bavwin000官方网站 :表S2)。婴儿喂养EVC001的分类分布存在差异,而不是那些没有的人。婴儿美联储EVC001(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba= 29), 10个细菌属占群落的99%GydF4y2Ba双歧杆菌属GydF4y2Ba代表任何鉴定的属的90%的90%的95个鉴定的属(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.0001, Kruskal-Wallis test) (Fig.vwin000官方网站 一种)。GydF4y2Ba

图1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

evc001喂养婴儿和对照组宏基因组阅读的分类。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba两组婴儿中最高细菌属的相对丰度。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba属的细菌物种的相对丰度GydF4y2Ba双歧杆菌属GydF4y2Ba在群之间确定的属。GydF4y2BaCGydF4y2Ba基于层次聚类的应变级分析GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Ba亚种。参考基因组亚群的基因家族谱从全球(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba = 38) strain analysis. Each column represents the presence or absence of genes in a sample or a reference genome with respect to the total pangenome. All samples from EVC001-fed infants clustered together withB. Longum.GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.对象的GydF4y2BaATCC 15697(GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba),而对照组婴儿的样本则与其他婴儿单独聚类GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba亚种GydF4y2Ba(GydF4y2Ba例如。,GydF4y2BaB. suis, B. longumGydF4y2Badj01a.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba和GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2BaNCC2705)。基因家族功能分析证实EVC001样本中主要为GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba由于存在独特的基因(例如,Blon_2348GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba),而基因仅存在GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.longumGydF4y2Ba(例如,阿拉德;araA),从对照婴儿开始在社区中大量存在。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-值计算每个基因通过Fisher的精确测试根据组GydF4y2Ba

在对照组(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba = 31), 68 genera were identified, of which双歧杆菌属GydF4y2Ba平均占总菌群的38%,而其他菌群所占比例尤其高于evc001饲养组GydF4y2Ba梭状芽胞杆菌GydF4y2Ba(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba = 0.01那GydF4y2BaKruskal-Wallis测试;无花果。GydF4y2Bavwin000官方网站 一种)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba在这内GydF4y2Ba双歧杆菌属GydF4y2Ba鉴定出八种种类,其中GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Ba是最丰富的,占evc001定殖婴儿总鉴定细菌种类的86%,而对照组为19% (GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.0001, Kruskal-Wallis test; Fig.vwin000官方网站 b)。其他检测到的双歧杆菌包括在内GydF4y2Bab .谕令GydF4y2Ba和GydF4y2BaB. Bifidum,GydF4y2Ba其分别在对照婴儿的微生物组中分别占9.4和7%,并且在EVC001-殖民化基团中具有相当少的(分别为1.4%和0.4%)。GydF4y2Ba

歧视这一点GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba种在亚种水平上,并决定了丰度GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba无性系种群。GydF4y2Ba对象的GydF4y2Ba和GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba无性系种群。GydF4y2BalongumGydF4y2Ba将微生物组组成的变化与定殖联系起来GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba,我们进行了菌株级分析GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba使用PanPhlan提供的全基因组基因-家族数据库。这个数据库包括38个菌株的基因GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba亚种(例如,GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.Longum,B. LongumGydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.婴儿,GydF4y2Ba和GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.Suis.GydF4y2Ba).粉甘油平均恢复了所有基因的98.8%GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.对象的GydF4y2BaATCC 15697 [GydF4y2Bavwin000官方网站 从evc001喂养组的每个样本中提取,代表2449个基因组基因家族。相比之下,对照组的19个婴儿缺乏可检测到的阅读图谱GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba宏基因组中的亚种基因。其余的对照样本(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba = 12) reported 43% coverage ofb .对象GydF4y2Ba基因,GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.longumGydF4y2BaNCC2705展示了1,708个Pangenome基因家族的最高基因覆盖率(79%)。GydF4y2Ba

样本和4个有代表性的参考基因组基于菌株之间的两两相似性进行层次聚类,通过基因家族谱之间的Jaccard距离计算(图)。GydF4y2Bavwin000官方网站 c).生成的热图显示GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.对象的GydF4y2Ba比其他国家丰富得多吗GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2BaEVC001组的亚种。独特的基因座GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba参考基因组和样本GydF4y2Bab .对象GydF4y2Baevc001喂养的婴儿显示了更丰富的关键基因,包括人乳寡糖(HMO)利用集群[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].这些基因完全缺席,其中31个婴儿在没有喂食的31个婴儿中GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001,表明GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba除非喂食婴儿,否则特别珍稀(只有6%的婴儿)GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001。独特的基因GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.longumGydF4y2Ba使阿拉伯糖消费特征(araD和araA)显著增加GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba无性系种群。GydF4y2BalongumGydF4y2Ba在殖民地殖民地的婴儿罕见GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001。这些研究结果在一起表明GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba是占主导地位的GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba婴儿喂养的亚种GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.对象的GydF4y2Baevc001,那GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba除非婴儿在临床试验期间喂婴幼儿,否则在这些婴儿中非常罕见。高水平GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba持久性先前在婴幼儿喂养EVC001与Pangenome分析一起报告的目的,这表明这种菌株的婴儿稳定定植。这与其他模型一致地检查其共存主机中宿主相关的肠道微生物的有效和耐用的定植[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ]以及我们之前通过16S rDNA测序对粪便样本进行的纵向分析[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].在微生物多样性方面,我们之前报道过,Shannon指数测量的群落丰富度(alpha多样性)没有差异,但UniFrac距离和Jaccard指数测量的类群相对丰富度和群落稳定性(beta多样性)存在差异[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

EVC001的殖民化与减少的arg负担有关GydF4y2Ba

我们鉴定了来自霰弹枪测序数据的596,631个婴儿肠道微生物基因,其中80,925个喂养的29个婴儿是独一无二的GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001和313,683个微生物基因是31个未喂养婴儿的样本所特有的GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001。两组共有205023个微生物基因。利用BLASTX针对综合抗生素耐药数据库(CARD)进行类型搜索,筛选meta基因组中是否存在ARGs。经过质量过滤的BLAST结果(见GydF4y2Bavwin000官方网站 ),确定了652个args(附加文件GydF4y2Bavwin000官方网站 :表S3)。evc001喂养组报告的总微生物基因中平均有0.01%的arg(最小值= 0.001%;max = 0.18%;SEM = 0.006%),有285种不同arg(图。GydF4y2Bavwin000官方网站 , a),其中33例仅在EVC001组中发现,百分比极低(< 0.05%)。没有喂养的婴儿GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba在EVC001中,这些arg平均占总宏基因组reads的0.09% (min = 0.004%;max = 0.24%;SEM = 0.01),共鉴定出612种不同arg。在这612款arg中,有360款属于这一群体。因此,喂养EVC001的婴儿,其微生物组中的arg平均减少90% (GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.0001, Mann-Whitney test).

图2GydF4y2Ba
figure2GydF4y2Ba

每个宏基因组样本中总抗性谱的相对丰度。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba与每个样品的总偏心组相比,相对丰富的抗生素抗性基因(Args)。每个点代表样品(控制,GydF4y2BaN.GydF4y2Ba= 31;EVC001-fed,GydF4y2BaN.GydF4y2Ba= 29)。箱形图表示四分位数范围(IQR),水平线表示第25百分位、中位数和第75百分位。须分别代表从第一和第三四分位开始的1.5倍IQR内的最低值和最高值。顶部的星号表示有意义GydF4y2BaP.GydF4y2Ba值(Mann-Whitney测试)。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba根据其分类鉴定的arg的相对丰度。颜色的深浅代表同一细菌纲的属。顶部的星号表示有意义GydF4y2BaP.GydF4y2Ba值(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)GydF4y2Ba

为了比较ARGs的微生物分类学归属,根据NCBI分类指南,结合MEGAN的最低共同祖先(LCA)方法,将最佳BLAST命中的652个ARGs分配到不同的类群[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].共有41个细菌属于分类为652次args的细菌属,其中GydF4y2Ba埃斯克里希亚洲GydF4y2Ba那GydF4y2Ba拟杆菌,葡萄球菌GydF4y2Ba和GydF4y2Ba锦绣钛GydF4y2Ba与大多数args(分别为68.9,5,4和2.6%)有关。考虑到抵抗力内的分类含量,来自对照婴儿的Metagenomes具有17个细菌属,具有相对丰度> 0.001%,具有GydF4y2Ba埃斯克里希亚洲GydF4y2Ba-ARGS占总梅萨胺的约0.054%(图。GydF4y2Bavwin000官方网站 b).在evc001饲养组中,只有12个细菌属的相关ARGs相对丰度为> 0.001%。GydF4y2Ba埃斯克里希亚洲GydF4y2Ba也是携带大部分arg的属,但对整个宏基因组的贡献显著低于对照组(0.003%)(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba= 0.001, Kruskal-Wallis检验;无花果。GydF4y2Bavwin000官方网站 b)。GydF4y2Ba

EVC001显着降低了关键抗生素抗性基因的丰富GydF4y2Ba

在对照组婴儿的样品中唯一鉴定的args中,三个以大于0.1%的相对丰度存在,并与之相关GydF4y2Ba梭状芽胞杆菌GydF4y2Ba属。具体地,鉴定了在同一操纵子上发现的TETA(P)和TETB(P)。TETA(P)是内膜四环素流出蛋白,TETB(P)是核糖体保护蛋白,两者均赋予四环素的抗性[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].mprF仅在对照组婴儿的样本中发现,它通过在细菌膜上的磷脂酰甘油带负电荷作用,并对破坏细胞膜(包括宿主产生的防御素)的抗生素阳离子肽产生耐药性[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

经跨样本归一化后,发现两组间有38个arg存在显著差异(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.01, Kruskal-Wallis test). All 38 ARGs were significantly lower in the EVC001-fed group compared to the controls (Fig.vwin000官方网站 a).值得注意的是,与对照组相比,evc001喂养组的样品中没有任何arg值显著升高(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba > 0.05, Kruskal-Wallis test). Genes enriched in the metagenome of infants in the control group were found to confer resistance to beta-lactams, fluoroquinolones, and macrolides, and 12 genes conferred resistance to multiple drug classes.

图3GydF4y2Ba
图3GydF4y2Ba

最重要的抗生素抗性基因类型的比较。GydF4y2Ba一种GydF4y2BaEVC001喂养婴儿和对照中鉴定的最显着不同抗生素抗性基因(ARGS)的相对丰度(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.02;Bonferroni)。百分比是相对于整个宏基因组而言的。这些arg提供了对不同药物类别的耐药性,包括β -内酰胺类、氟喹诺酮类和大环内酯类。arg按基因名称分组,然后是CARD识别条目(ARO)。彩色条代表ARG已知对其产生耐药性的药物类别。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba热图显示了对总arg的分层聚类分析(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba = 652). Two groups were identified, one characterized by a lower-ARG carriage, containing most of the samples from infants fed EVC001 and one characterized by a higher overall carriage, containing most samples from infants in the control group. Genes clustered based on similar biological mechanisms implicated in drug resistance (seevwin000官方网站 ).GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 用kruskal-wallis测试计算栏上的栏上的值,用Bonferroni校正标准化GydF4y2Ba

样本和总args的分层聚类(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba= 652),使用完全连锁法生成了两个主要的样本簇(图。GydF4y2Bavwin000官方网站 b)。EVC001喂养婴儿的大部分样品在下args丰度面板内聚集在一起。args的行聚类导致两组。最丰富的基因聚集在一起,并被注释为与抗微生物抗性机制直接相关。vwin德赢官网网页vwin德赢国际米兰特别地,由MDTB和MDTC编码的蛋白质形成异多聚合物复合物,其导致多药转运仪[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].acrd是氨基糖苷源泵,其表达由抗凸版和Cpxar调节,这也是在重要的args中鉴定的,并且最能表征GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].我们还鉴定了AcrB和TolC,它们形成了多药外排复合物AcrA-AcrB-TolC,赋予了多药耐药性[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].此外,未喂养EVC001的婴儿RosA和RosB显著增多;这些基因形成外流泵/钾反向转运系统(RosAB) [GydF4y2Bavwin000官方网站 ].属于Multidrug Efflux系统,EMRA-EMRB-TOTC的三个基因,首先确定GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Bavwin000官方网站 [来自对照婴儿的样品也显着更丰富。在该配合物中,EMRB是电化学梯度动力运输器,而EMRA是连接器,并且TOLC是外膜通道[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].该复合物对氟喹诺酮类药物、萘啶二酸和硫代乳霉素具有耐药性。GydF4y2Ba

大多数(76%)的显着不同的args被分类为属于的细菌GydF4y2Ba肠杆菌科GydF4y2Ba家庭(例如,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba)其丰度与args的存在成比例(r = 0.58;GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.00001,皮尔逊)(图。GydF4y2Bavwin000官方网站 b).的绝对丰度(通过qPCR测定)GydF4y2Ba肠杆菌科GydF4y2Ba显著降低(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.0001)。GydF4y2Bavwin000官方网站 ).其他args报告了多个分类作业GydF4y2Ba变形菌门GydF4y2Ba门。根据NCBI的分类作业和卡数据库,他们可以源自多种密切相关的物种中的任何一种。其中包括:Efflux泵码码;MDTG蛋白质,似乎是转运蛋白主要促进剂超家族的成员,这赋予抗氟霉素和脱氧核酸症的抗性[GydF4y2Bavwin000官方网站 ];鲍尔,响应 - 稳压器赋予多药电阻[GydF4y2Bavwin000官方网站 ];以及marA,一种在不同抗生素类别存在时过表达的全局激活蛋白[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].在附加文件中报告了治疗组arg的全球统计分析GydF4y2Bavwin000官方网站 :表S6。GydF4y2Ba

图4GydF4y2Ba
装具GydF4y2Ba

量化的GydF4y2Ba肠杆菌科GydF4y2Ba家庭通过组特定的QPCR。数据表示为日志GydF4y2Ba10GydF4y2Ba每微克粪便基因组DNA的CFU。箱线图中的数据显示了中位数、第一和第三个四分位数(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.0001,曼-惠特尼检验)GydF4y2Ba

EVC001的殖民化降低了args的总丰富和组成GydF4y2Ba

为了比较EVC001定居对arg多样性的总体影响,我们使用稀疏曲线比较每个样本内的alpha多样性(例如,独特arg的数量)。值得注意的是,arg的多样性与每个样本的序列数无关。GydF4y2Bavwin000官方网站 a).总体而言,evc001喂养的婴儿的独特arg数量是对照组婴儿的一半(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba= 0.001,GydF4y2Bat -GydF4y2Ba测试)。评估样本间的全球抗性差异和EVC001定殖对两个研究组整体多样性的影响大小。将Bray-Curtis不相似性矩阵转换为主坐标分析(PCoA)显示,与对照组相比,evc001定殖组的样本聚类紧密,而对照组的分布更广(图2)。GydF4y2Bavwin000官方网站 B;GydF4y2BaP.GydF4y2Ba= 0.001,F-test). This indicates that samples from the EVC001-colonized infants had a less abundant and less diverse resistome compared with the control group samples. Colonization with EVC001 contributed to a greater than a 30% reduction in global AR diversity in the infant gut microbiome than in the gut of the controls (R2GydF4y2Ba = 0.31,P.GydF4y2Ba= 0.001,阿多尼斯)。最后,无论婴儿是剖腹产还是产道出生,对照组检测到的arg丰度没有统计学上的显著差异(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba= 0.30;或婴儿是否暴露于产时抗生素(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba= 0.5;Mann-Whitney)。相反,婴儿喂养GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001具有显着降低的arg丰富,独立于递送模式,抗生素暴露或任何其他临床变量。GydF4y2Ba

图5GydF4y2Ba
figure5GydF4y2Ba

婴儿抗性体的多样性分析GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001殖民化。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba稀疏曲线显示与越来越多的序列相关的独特抗生素抗性基因(Args)的数量。EVC001和对照组都提出了类似的曲线趋势,表明测序深度与抗生素抗性的多样性无关。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-值是用非参数双样本计算的GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-蒙特卡罗排列测试(GydF4y2BaN.GydF4y2Ba = 999).B.GydF4y2Ba基于Bray-Curtis不同相似度矩阵的主坐标分析(PCoA),计算了全局抗性谱。喂食evc001的样本聚类紧密,这表明它们与分布更分散的对照组相比,拥有相似的抗性体。的影响GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001本身的殖民化占总解释的变异(Adonis)的31%。这GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 基于原始数据排列的顺序总和,使用F-Tests计算值GydF4y2Ba

在Silico预测args的体外验证GydF4y2Ba

为了验证粪便样本中是否存在ARG,设计了PCR引物对,针对对照组婴儿抵抗体中最丰富的7个ARG。除针对mfd基因的引物对未从任何样本中扩增外,至少有一半的粪便样本中获得扩增物。扩增产物的核苷酸序列分析证实了序列同源性,与预测靶基因的开放阅读框(ORF)的核苷酸同源性为> 70%。核苷酸序列分析显示,与肠道细菌中编码预期功能的基因组区域具有较高的同源性(85-99%),预测的氨基酸序列在相应编码蛋白中含有高度保守的结构和功能域(附加文件)GydF4y2Bavwin000官方网站 :表S4)。GydF4y2Ba

为了确定是否存在全长、功能性的arg,以及这些arg与个体抗性表型的关系,我们从4个有代表性的对照婴儿的粪便样本中分离得到细菌。EMB用于筛选乳糖发酵大肠菌群(例如,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba),经散弹宏基因组测序鉴定,在两组个体中都含有最多的arg。用MinION测序仪对12个分离株进行全基因组测序,平均覆盖率为18× (min 5.4;马克斯40)(表GydF4y2Bavwin000官方网站 ).通过BLASTN对NCBI核苷酸数据库(GydF4y2Bahttps://github.com/rrwick/PorechopGydF4y2Ba),揭示三个分离株分类为GydF4y2BaRaoultella planticolaGydF4y2Ba剩下的9个是GydF4y2Ba大肠杆菌。GydF4y2Ba通过TBLASTN对12株组装的分离株进行CARD蛋白序列查询。通过shotgun宏基因组学鉴定的40种差异最大的arg (GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.02;除rob (ARO:3003049)和rob (ARO:3004108)外,在12个基因组中全部或部分(平均鉴定> 93%)被证实。后一种基因是不存在的GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba和GydF4y2Bar . planticolaGydF4y2Ba基因组,但在其他未分离的类群中预测(表GydF4y2Bavwin000官方网站 ).GydF4y2Ba

表2从4名对照受试者获得的12个细菌分离株的装配统计和ARGs分配总结GydF4y2Ba

为这些分离株测定最小抑制浓度(MIC)至氨苄青霉素,头孢哌管,头孢噻肟,头孢唑啉,四环素和庆大霉素。除了从同一婴儿获得的三个分离物(7174),所有分离物都表现出氨苄青霉素抗性。在多药隔离物中,对氨苄青霉素,Cefazolin和四环素的抗性最为常见。检测到对庆大霉素没有抵抗(表GydF4y2Bavwin000官方网站 ).GydF4y2Ba

表3 μg/mL抗生素的最低抑菌浓度(MIC)GydF4y2Ba

讨论GydF4y2Ba

b .对象GydF4y2Ba是一个着名的生物,具有悠久的进化适应历史,对母乳喂养的婴儿肠道[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].我们之前已经证明了GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001能够改造婴儿肠道微生物组,降低普通的肠毒群,特别是属于属于的GydF4y2Ba变形菌门GydF4y2Ba和GydF4y2Ba厚壁菌门GydF4y2Ba门(例如,GydF4y2Ba埃斯克里希亚洲GydF4y2Ba和GydF4y2Ba梭状芽胞杆菌GydF4y2Ba) [GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].在目前的研究中,散弹宏基因组学使我们证实了GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba作为主要GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba利用菌株水平分析工具对evc001喂养的婴儿进行亚种分析[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].亚种内GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Ba在它们的遗传结构中存在重大差异,对碳水化合物利用表型有深刻的影响[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].特别是,在母乳中占第三大成分的母乳寡糖(HMOs)不能被婴儿消化或没有被消化GydF4y2BaB. Infantiis,GydF4y2Ba都消失在凳子上了[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Ba66GydF4y2Ba那GydF4y2Ba67GydF4y2Ba那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].HMOs的几个功能已经被提出,包括免疫信号分子,以及作为益生元的作用[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].因此,牛奶中HMO浓度的变化可能会在微生物组组合物中触发因健康结果的影响[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

来确认主导GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2BaEVC001喂养婴儿肠道微生物组中的亚种确实是GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Basubsp.GydF4y2Ba.对象的GydF4y2Ba,我们收集了一个由38个可用亚种的12,000个基因组成的全基因组数据库GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba.基于基因存在或缺失的层次聚类分析显示,evc001喂养的婴儿与GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba参照基因组(ATCC 15697),而对照组与其他基因组单独聚类GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba亚种。在基因水平上,HMO聚类1是最大的HMO利用基因聚类,在HMO利用基因中是缺失的GydF4y2Balongum无性系种群。longumGydF4y2Ba压力(GydF4y2Bavwin000官方网站 ,仅在evc001喂养组存在,而对照组则不存在。相反,l -阿拉伯糖异构酶(araA)和l -5-磷酸核酮糖- 4-异丙基酶(araD)赋予木糖和阿拉伯糖发酵的遗传能力GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba但是现在GydF4y2BaB. Longum Subspecies LongumGydF4y2Ba[GydF4y2Bavwin000官方网站 只在对照组的样本中发现GydF4y2Ba双歧杆菌浪星GydF4y2Ba无性系种群。GydF4y2BalongumGydF4y2Ba.值得注意的是,60%的对照组没有任何可检测量的任何GydF4y2BaB. Longum.GydF4y2Ba亚种基因在它们的梅塔群中,表明这些细菌缺失这些婴儿的微生物,无论它们是阴道还是通过剖宫产。这可能反映了一般人群中的关键肠道细菌共生的代理损失,因为剖腹产部分,抗生素使用和过去的公式喂养了[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

考虑到婴儿的肠道菌群在出生后的头两年通常具有较低的定殖抗性,婴儿有充足的机会获得共生微生物的耐抗生素群体,包括从医院环境[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].一旦建立,这些耐药群体可能会促进arg的传播。耐抗生素感染给美国卫生保健系统和人口带来了巨大的健康和经济负担[GydF4y2Bavwin000官方网站 ],而arg的传播或藏匿它们的生物受到限制的手段有限[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].最近的研究表明,出生时从母亲和周围环境传播的微生物影响婴儿肠道微生物群的初始定植;然而,很少有研究调查医院细菌定植的婴儿肠道微生物群中的ARG负担。最近,Taft等人表明,在孟加拉国,双歧杆菌的丰富与arg的显著减少有关[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].在目前的研究中,我们证明了即使在没有抗生素选择压力的情况下,北加州人口中健康的母乳喂养婴儿的肠道中也含有多种编码对几种临床相关抗生素类别抗性的基因。此外,我们证明了通过调节肠道微生物群来减少arg丰度的干预的可能性。我们的结果表明,靶向益生菌干预的效果可以重现在ARG丰度的下降观察GydF4y2Ba双歧杆菌属GydF4y2Ba-主要来自发展中国家的婴儿[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].事实上,喂养EVC001导致ARG负担显著降低90%(0.01%),相对于未喂养EVC001的婴儿(0.1%)。在我们的研究中,arg的计算相对丰度低于成人(约0.4-1%)[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ,但与其他针对婴儿的研究相似[GydF4y2Bavwin000官方网站 那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

在讨论跨样规范化后,我们无法识别来自婴儿的样本的任何arg增加GydF4y2Bab .对象GydF4y2BaEVC001;然而,对照样本中有38个arg显著高于喂食EVC001的婴儿。已知这些基因会对多种药物产生耐药性,包括氟喹诺酮类、β -内酰胺类、大环内酯类和四环素类抗生素。共有12个显著的arg被归类为多药耐药基因,两组间报道的差异最大。之前针对健康婴儿的靶向或功能性研究也发现了类似的arg,包括那些具有四环素耐药性(tet)的arg,我们只在对照组婴儿中发现了[GydF4y2Bavwin000官方网站 ];以及一些多药arg [GydF4y2Bavwin000官方网站 ,包括CRP、emrD、CpxR (ARO:3004055)GydF4y2Ba那GydF4y2Ba这是两组中最显着的不同基因(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.0001)。在我们的研究中也发现了早产儿肠道微生物群中类似的ARG丰度和特性[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].GydF4y2Ba

这些结果表明,殖民GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba婴儿体内的EVC001不仅重塑了母乳喂养婴儿的肠道微生物组组成,而且还可能通过减少ARG的携带提供即时的翻译影响。多样性分析表明,与对照组相比,evc001喂养组独特arg的数量显著减少,而且这种趋势与测序深度无关。这方面可能转化为临床相关性,因为婴儿的感染起源于肠道微生物群,可能对更广泛的药物类别表现出耐药性。需要进一步的研究来确定停止益生菌后这些ARG的持久性。GydF4y2Ba

Although the use of shotgun metagenomics coupled with clinical databases (e.g., CARD) offer a direct means of identifying ARGs on a global, high-throughput scale, short-read sequencing might represent a challenge when linked to the resistance of specific genes that may originate from multiple strains of the same species [vwin000官方网站 ].此外,arg的计算注释可能很难转化为实际的耐药性,一些证据显示预测的表型和实际的表型之间存在脱节[GydF4y2Bavwin000官方网站 ].另外,独立于遗传变异的替代机制可以赋予耐药性,包括生物膜形成[GydF4y2Ba84GydF4y2Ba那GydF4y2Ba85GydF4y2Ba那GydF4y2Bavwin000官方网站 ].同样,arg的缺失也不一定转化为非抗性表型。然而,通过测序对照婴儿粪便DNA中最丰富的ARGs的orf,我们证实了这些基因存在于分析的粪便样本中。更重要的是,在经过精心筛选的序列数据库(如pfam和COG)中进行同源性搜索,确认获得的基因序列包含功能保守的结构域。抗生素耐药表型的基因组测序和表型确认证实了许多这些基因的存在和抗生素耐药性之间的关联,使用临床定义的断点,强调这些基因存在于预测的生物体中,并证明与临床相关的耐药性水平。GydF4y2Ba

最后,重要的是要注意,该研究仅限于公共数据库中发现的args,因此仅包含参与抗生素抗性的已知基因。因此,由于我们的分析排除了卡数据库中未发现的染色体突变和新颖的染色体突变和新颖的抗性基因,因此所识别的args可能不足。但是,大多数args都与之相关GydF4y2Ba变形菌门GydF4y2Ba和GydF4y2Ba厚壁菌门GydF4y2Ba,喂养的婴儿数量显著减少GydF4y2Bab .对象GydF4y2Baevc001与那些没有的人相比GydF4y2Ba.GydF4y2Ba长期以来一直建立自然,非转换抗生素抗性表型,最近的系统分析已经区分自然和获得GydF4y2Ba双歧杆菌属GydF4y2Ba抗性表型[GydF4y2Bavwin000官方网站 ];然而,GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba缺乏任何已知的毒性基因或质粒[GydF4y2Bavwin000官方网站 ],目前还没有研究描述水平基因转移事件的证据。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

新生儿中抗生素耐药细菌的定植是arg在人群中继续传播的一个主要风险。肠道菌群的定植GydF4y2Bab .对象GydF4y2Ba生命早期的EVC001减少了这些arg的丰度,以及在个体之间窝藏和传播它们的类群。结合医学界的适当药物管理实践,这种调节肠道微生物群的方法可以帮助减少arg的负担和多样性,并限制其在个人之间的传播。还需要更多的研究来确定这些变化是否具有临床相关的好处,例如改变耐抗生素医院感染的流行率。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

本研究生成的测序库公开存放在NCBI序列阅读档案(SRA)中,登录号为PRJNA390646。全基因组集合在NCBI中,登录号为PRJNA472982。GydF4y2Ba

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下载参考GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

本研究中的测序在Vincent J.Coate Gensomics测序实验室进行了UC Berkeley,由NIH S10 OD018174仪器补助金提供支持。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

这项研究是由进化生物系统公司资助的。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

GC、SAF、JTS和MAU参与了研究或实验设计。RMD、SAF、LC和RM进行了实验。GC和DV分析了数据。JTS组织了临床试验的设计和操作。所有作者都参与了手稿的写作、编辑和批准。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba詹妮弗·t·SmilowitzGydF4y2Ba或GydF4y2Ba马克·a·安德伍德GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

道德声明GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

该研究是根据加利福尼亚大学,戴维斯机构审查委员会和注册的批准进行的GydF4y2BaClinicalTrials.govGydF4y2Ba在研究NCT02457338。所有实验都是按照相关的指导和规定进行的。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

受试者或其法定监护人同意参与和发表研究结果。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

GC,RMD,SAF,LC,RM和DV由Evolve Biosystems,Inc。使用GydF4y2Ba

附加信息GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

官方下载Springer自然仍然是关于发表地图和机构附属机构的司法管辖权索赔中立。GydF4y2Ba

附加文件GydF4y2Ba

额外的文件1:GydF4y2Ba

表S1。GydF4y2Ba研究人口统计学。(Doc 50 KB)GydF4y2Ba

额外的文件2:GydF4y2Ba

表S5。GydF4y2Ba用于扩增来自粪便DNA的七种差异表达的Args的引物序列(Doc 30 Kb)GydF4y2Ba

额外的文件3:GydF4y2Ba

表S2。GydF4y2Ba样本的全球分类学概况。样本间个体类群的相对丰度(%)。分层是指不同的分类等级(k =界;p =门;c =类;o =订单;f =家庭;g =属;s =物种;t =应变)。 Within the same taxonomic rank (e.g., Family, “f__”) the total relative abundance sum up to 100%. (XLS 427 kb)

额外的文件4:GydF4y2Ba

表S3。GydF4y2Ba样本的全球ARG概况。针对CARD数据库的每个样本的质量过滤命中数。第一列标注顺序为:基于NCBI参考序列数据库的蛋白ID;抗生素耐药基因ID根据CARD数据库和蛋白质名称。(XLS 312 kb)GydF4y2Ba

额外的文件5:GydF4y2Ba

表S6。GydF4y2BaKruskal-Wallis检验,根据治疗状态对每个ARG进行事后修正。(51 XLSX kb)GydF4y2Ba

额外的文件6:GydF4y2Ba

表S4。GydF4y2BaORFS的核苷酸序列分析。来自Illumina的选定开放阅读框架(ORF)的全局对齐结果读取组件。报告了args中鉴定的选定ORF的Blassx和Blastn评分。(XLSX 11 KB)GydF4y2Ba

权利和权限GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(GydF4y2Bahttp://creativeCommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba),它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制,前提是你给予原作者和来源适当的荣誉,提供一个到知识共享许可协议的链接,并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据,除非另有说明。GydF4y2Ba

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G.卡萨布里,R.M.杜阿尔,万斯,D.P.GydF4y2Baet al。GydF4y2Ba早期肠道微生物群落调节降低了耐抗生素细菌的丰度。GydF4y2BaAntimicrob抵抗感染控制GydF4y2Ba8,GydF4y2Ba131(2019)。https://doi.org/10.1186/s13756-019-0583-6GydF4y2Ba

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关键字GydF4y2Ba

  • 抗生素抗性基因GydF4y2Ba
  • 梅泰群系GydF4y2Ba
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  • 宿主的相互作用GydF4y2Ba
  • 微生物学GydF4y2Ba
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